극작가 셔먼 맥도날드와 배우 윌 나이틀리의 딸로 태어난 키이라 나이틀리는 학교와 유스 클럽 프로덕션에서 연기를 배웠다. 1994년 <빌리지 어페어>에서 나타샤 조던 역으로 영화계에 데뷔한 후 영화 <헬시언 데이스>, TV 시리즈 , ,<더 홀>에서 매력적이지만 불량한 소녀로 출연하며 연기경력을 쌓아갔다.
키이라 나이틀리가 주목을 받기 시작한 것은 2002년 작품 <슈팅 라이크 베컴>을 통해서였다. 이 작품에서 보이시한 모습으로 관객들에게 깊은 인상을 남긴 그녀는 2002년에 출연한 TV 시리즈 로 배우로서의 자리를 확고히 다지게 된다. 특히 2003년에 출연한 <캐리비안의 해적: 블랙 펄의 저주>에서는 강인한 체력과 탁월한 검술을 요구하는 배역을 놀랍도록 잘 소화해 내어 조니 뎁, 올랜도 블룸과 함께 조화로운 연기를 선보이기도 하였다.
로맨틱 코미디의 황제라 불리는 리처드 커티스 감독의 <러브 액츄얼리>에서는 콜린 퍼스, 휴 그랜트, 로라 리니, 리암 니슨, 알란 릭맨, 엠마 톰슨 등 쟁쟁한 연기파 배우들과 호연을 펼쳤고, 배우들의 호연 덕분에 <러브 액츄얼리>는 흥행면에서도 대 성공을 거두게 된다.
2004년에는 제리 브룩하이머의 <킹아더>에도 캐스팅되었다. 이 영화에서 그녀는 아더왕의 배역을 맡은 클라이브 오웬의 상대역인 귀네비어 왕비 역을 맡았는데, 매력적이고 기품있는 왕비의 모습을 선보여 찬사를 받았다. 이후 <캐리비안의 해적> 시리즈를 통해 할리우드 톱스타로서 자리를 잡았고 <오만과 편견><어톤먼트>으로 아카데미와 골든글로브 여우주연상에 노미네이트 되면서 연기력까지 인정받았다.